FRET: come trovare la distanza tra due molecole

Esistono tecniche per le quali si può estrarre informazione di colocalizzazione tra molecole come ad esempio le proteine. Una di queste è nota come fluorescence resonance energy transfer (FRET) che sfrutta un’altra proprietà di tipo quantistico ovvero il trasferimento risonante di energia tra donatore e accettore.

In cosa consiste la FRET

La FRET consiste essenzialmente nell’effetto combinato di due molecole in grado di emettere fluorescenza in seguito ad una eccitazione. La fluorescenza è realizzata mediante dei fluorofori. In particolare uno dei due, detto donatore, riceve un’onda luminosa ad una lunghezza d’onda specifica (tipicamente quella di assorbimento). Il donatore eccitato emette fluorescenza secondo il suo spettro tipico di emissione, che se si sovrappone a quello di assorbimento dell’accettore, trasferisce l’eccitazione in maniera risonante all’accettore. Quest’ultimo infine emetterà un quanto luminoso.

Principi fisici della FRET

Gli aspetti fisici dietro la FRET sono molteplici e anche di natura quantistica. La molecola coinvolta infatti assorbe e riemette energia. L’onda risente quindi la presenza di radiazione elettromagnetica e quindi di un campo elettrico che perturba il momento di dipolo della molecola, rendendola eccitata.

La molecola dopo un certo periodo di eccitazione decade nello stato fondamentale. Tra i motivi fisici abbiamo il principio di indeterminazione di Heisenberg, ma anche dai tempi di assorbimento ed emissione.

Come viene realizzata la fluorescenza

Un fluoroforo è una molecola che dopo aver assorbito fotoni, emette della fluorescenza. Negli ultimi anni, per gli esperimenti di biologia molecolare, gli scienziati ricorrono all’uso di una proteina detta proteina verde fluorescente. Questa proteina, detta GFP, caratterizza l’emissione della fluorescenza della medusa Aequorea Victoria e presenta una struttura di foglietti beta a forma di barile (Beta-barrel).

La GFP deve prima essere colpita da una radiazione, che permette ai suoi elettroni di passare nello stato eccitato (assorbimento); dopo gli elettroni ritornano nello stato fondamentale e riemettono un’altra radiazione, ma con energia però inferiore a quella iniziale (emissione). Per l’emissione i ricercatori utilizzano sia la radiazione ultravioletta che una radiazione nello spettro del visibile. In entrambi i casi la GFP emetterà una radiazione di colore verde che corrisponde ad una lunghezza d’onda di 505 nm.

L’importanza di questa tecnica

La tecnologia FRET si presenta in duplice modalità. Si può rivelare la luce emessa alla lunghezza d’onda massima di emissione dell’accettore. L’intensità della luce dipende dall’efficienza del processo dalla distanza tra le due molecole. Questo primo approccio è utile quando la distanza tra le molecole in esame non si modifica. Un secondo approccio più recente è quello di ottenere informazioni rilevanti misurando l’emivita (ovvero il tempo in cui decade metà della massa iniziale dell’elemento) del fluoroforo donatore in presenza e in assenza dell’accettore. Viene utilizzato nei casi in cui la distanza tra le due molecole non è costante, come nel caso di ripiegamento proteico.

Applicazioni principali

Le applicazioni iniziali della FRET consistono nell’individuazione e lo studio di due molecole di interesse che si trovano in stretta vicinanza. Inoltre è uno strumento usato per quantificare le interazioni tra macromolecole biologiche (proteina-proteina, proteina-acido nucleico, proteina-lipide). È possibile poi monitorare i cambiamenti conformazionali all’interno delle macromolecole. Infatti marcando in due siti differenti, lontani tra loro più di 10 nanometri: se la proteina cambia conformazione, avvicinando i due siti, la FRET avrà luogo ed sarà in grado di generare segnale.

La FRET trova quindi applicazione nella biologia molecolare e cellulare che negli ultimi anni ha permesso di visualizzare direttamente fenomeni di trasporto di membrana degli ioni, carboidrati e amminoacidi.

Le nuove frontiere

Tra le nuove frontiere vi è lo sviluppo di un nanosensore formato da una lunga catena polipeptidica costituita da due proteine fluorescenti, legate tramite legami covalenti ad un recettore per il metabolita che si desidera individuare. Questo permette di visualizzare la concentrazione delle biomolecole in vivo.